一、ELISA的道理

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶象征。结合在固相载体表表的抗原或抗体仍维吃熹免疫学活性，酶象征的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测按时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表表的抗原或抗体起反映。用洗涤的步骤使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分隔。再参与酶象征的抗原或抗体，也通过反映而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈肯定的比例。参与酶反映的底物后，底物被酶催化成为有色产品，产品的量与标本中受检物质的量直接有关，故可凭据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效能很高，间接地放大了免疫反映的了局，使测定步骤达到很高的敏感度。

二、ELISA的类型

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定步骤中有三个必要的试剂：
（1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；
（2）酶象征的抗原或抗体，称为“酶联物”、“结合物”（conjugate）；
（3）酶反映的底物。凭据试剂的起源和标本的情况以及检测的具体前提，可设计出各类分歧类型的检测步骤。用于临床检验的ELISA重要有以下几种类型：

（一）　双抗体夹心法测抗原

双抗体夹心法是检测抗原最常用的步骤，操作步骤如下：
（1） 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
（2） 加受检标本，保温反映。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
（3） 加酶标抗体，保温反映。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量有关。
（4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产品。通过比色，测知标本中抗原的量。

在临床检验中，此法合用于检验各类蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只有获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和造备酶结合物而成立此法。如抗体的起源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好别离取自分歧种属的动物。如利用单克隆抗体，通常选择两个针匹敌原上分歧决定簇的单抗，别离用于包被固相载体和造备酶结合物。这种双位点夹心法拥有很高的特异性，并且能够将受检标本和酶标抗体一路保温反映，作一步法检测。

在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原别离和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反映中抗原过剩的后带景象，此时反映后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与尺度曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值一样，如按常法测读，所得了局将低于现实的含量，这种景象被称为钩状效应（hook effect），由于尺度曲线达到顶峰后呈钩状弯落。钩状效应严沉时，反映甚至可不显色而出现假阴性了局。因而在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，该把稳可测领域的最高值。用高亲和力的单克隆抗体造备此类试剂可减弱钩状效应。

倘若在被测分子的分歧位点上含有多个一样的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的统一单抗别离包被固相和造备酶结合物。但在HBsAg的检测中该把稳亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，显然每种亚型均有一样的a决定簇的反映性，这也是用单抗作夹心法该把稳的问题。

双抗体夹心法测抗原的另一把稳点是类风湿因子（RF）的滋扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充任抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，阐发出假阳性反映。选取F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而可解除RF的滋扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项查核指标。

双抗体夹心法合用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不合用于测定半抗原及幼分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

（二）双抗原夹心法测抗体
反映模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和造备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的分歧之处为以酶标抗原包办酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因而其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常选取本法。本法关键在于酶标抗原的造备，应凭据抗原结构的分歧，寻找相宜的象征步骤。

（三） 间接法测抗体
间接法是检测抗体常用的步骤。其道理为利用酶象征的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法（见图2-3）。操作步骤如下：
（1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。

（2）加稀释的受检血清，保温反映。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。

（3）加酶标抗抗体
？捎妹副昕谷薎g以检测总抗体，但通常多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地象征上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正有关。

（4）加底物显色
本法重要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的利益是只有变换包被抗原就可利用统一酶标抗抗体成立检测相应抗体的步骤。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。固然有时用粗提抗原包被也能获得现实有效的了局，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。出格该把稳除去能与通常健康人血清产生反映的杂质，例如以E.Coli为工程酶的沉组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli习染者血清中的抗E.Coli抗体产生反映
？乖幸膊荒芎杏朊副昕谷薎g反映的物质，例如来自人血浆某人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也产生假阳性反映。另表如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被成效。
间接法中另一种滋扰成分为正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一幼部门。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表表。因而在间接法中，抗原包被后通常用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封关（blocking）固相上的空余间隙。另表，在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以预防过高的阴性本底影响了局的判断。

（四）竞争法测抗体
当抗原资猜中的滋扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其道理为标本中的抗体和肯定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因而阳性反映呈色浅于阴性反映。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有滋扰物质，直接包被不易成功，可选取捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，而后参与抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，而后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反映。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA通常选取此法。另一种模式为将标本与抗原一路参与到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再参与酶标抗体，与结合在固相上的抗原反映
？笻Be的检测通常选取此法。

（五）竞争法测抗原
幼分子抗原或半抗原因不足可作夹心法的两个以上的位点，因而不能用双抗体夹心法进行测定，能够选取竞争法模式。其道理是标本中的抗原和肯定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。幼分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

（六）捕获包被法测抗体（经典步骤）
IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断钟祝间接法ELISA通常仅合用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中通常同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因而如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处置，以除去IgG的滋扰。在临床检验中测定抗体IgM时多选取捕获包被法。吓酌抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中蕴含针匹敌原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。而后参与抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶象征针匹敌原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正有关。此法常用于病毒性习染的早期诊断。甲型肝炎病毒（HAV）抗体的检测模式见图2-7.
类风湿因子（RF）同样能滋扰捕获包被法测定IgM抗体，导致假阳性反映。因而中和IgG的间接法最近颇受青睐，用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。

（七）ABS-ELISA法
ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为幼分子化合物，分子量244.用化学步骤造成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大幼分子形成生物素象征产品，象征步骤颇为轻便。生物素与亲和素的结合拥有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反映大得多，两者已经结合就极为不变。由于一个亲和素可与4个生物素分子结合，因而如把ABS与ELISA法可分为酶象征亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素象征的抗体（或抗原）包办原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）。在LAB中，固相生物素吓纂不象征的亲和素反映，而后再加酶象征的生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此弊端，在ELISA利用中有代替前者的趋向。由于ABS-ELISA较通常ELISA多用了两种试剂，增长了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA利用不多。

科研项目中检测微量的成分如细胞因子常选取本法。