媒介

生物分析能力是药物临床前钻研和临床钻研的基石能力，是JDB电子这类CRO机构助力国内表客户顺利推动药物开发过程的技术基础。生物分析固然是一门技术性很强实际性很强的工作领域，若是仅就分析看分析，仅就技术自身思虑技术对于研发过程中遇到各类情况和问题的解决可能会带来思路上的局限性。做好生物分析工作，离不开技术实际，更离不开有关基础理论知识的支持，实际反馈理论，理论领导实际，一些基础理论不仅具领导价值，有时也具启发性，有利于广拓视角。JDB电子美研幼编团队推诞生物分析系列专栏，约请能力域的资深专业人员从分歧的视角笔谈生物分析有关的话题。

目前热点和已上市的核酸药物重要蕴含mRNA和寡核苷酸两大类，mRNA既能够作为为疫苗，又能够作为医治性药物，必要差距性地思考其PK/PD的评估战术；寡核苷酸目前成药的重要是ASO和siRNA，这些核酸药物又两全了幼分子与大分子药物的一些PK/PD特点。

Part.1

基因医治与核酸类药物

基因医治目前有多个分歧层面的理解，狭义基因医治通常界说是使用正常的基因代替、纠正异常的基因，或者将异常的基因敲除以达到医治疾病的主张；谥行姆钌先ダ斫，狭义的基因医治也能够从另一个层面界说为通过纠正中心法令过程中出现的问题，如基因突变导致的职能性蛋白质缺失或异常等（拜见图1和图2），以达到医治疾病的主张。在广义的基因医治概想下，溶瘤病毒、细胞医治，核酸类药物均可被纳入基因医治的领域，但并不是所有的核酸药物都属于基因医治领域，如mRNA药物仅有一部门能够被纳入基因医治的领域。

图1. 基因突变影响盛开阅读框而不能形成有职能的蛋白

图2. 部门寡核苷酸药物针对的遗传病

目前的基因医治领域有两个离不开核酸的有趣的景象，即RNA滋扰和CRISPR基因编纂。RNA滋扰和CRISPR基因编纂也都是一种生物体内抗病毒习染的免疫机造，是在核酸水平上的免疫，有人称其为基因免疫或基因组免疫。而经典的免疫学里涉及的免疫系统中的免疫分子蕴含抗体、补体、配体、受体和细胞因子等成分通常都是氨基酸为根基组成单元的分子，没有核苷酸作为根基组分的分子的直接参加。

未来是否有更多类似于RNA滋扰和基因编纂的核酸层面的机造被挖掘而可能会进一步地丰硕我们对免疫学的认知，并且在基因组免疫领域的概想会越来越丰硕、发展，甚至逐步成为免疫学的一大分支，或许也能作为JDB电子一种额表等待。

核酸药物经过几十年的堆集，在近几年达到了发作期。目前国内表上市的基因医治药物重要是mRNA疫苗和重要针对遗传病的寡核苷酸类药物（如图3）。所以本文重要将核酸类药物分为mRNA药物和寡核苷酸药物两类，别离进行简要论述。

图3. 国际上市的重要核酸类药物（截至2023年3月，暂未列国内厂家产品）

Part.2

mRNA类产品的PK/PD调查战术

mRNA药物的优势蕴含：

（1）能够导入细胞，在体内直接表白主张蛋白；

（2）mRNA的降解通过细胞正常代谢实现，无显著的毒性；

（3）既能刺激体液免疫，又能刺激细胞免疫应答；

（4）既能够开发为疫苗，又能够开发为医治性药物等。

mRNA药物的弊端蕴含：

（1）不不变，易被核酸酶等降解；

（2）造备工艺复杂；

（3）使用纯生物药的出产蹊径；

（4）必要超低温运输等。

造订mRNA产品临床前药代动力学药效学（PK/PD）调查分析战术的前提是判断其属于疫苗还是医治性药物。两者存在以下分歧：

（1）编码蛋白的性质分歧，mRNA疫苗编码病毒或肿瘤抗原蛋白，通常少量蛋白表白就能够阐扬作用, 医治性药物则通常必要更高的蛋白表白量；

（2）递送要求分歧，疫苗无需组织特异性，mRNA医治性药物则进展递送到特定的组织后进行翻译表白；

（3）给药方式分歧，目前上市和在研mRNA疫苗多为肌肉注射，医治性药物则凭据具体医治性质常选取系统给药，甚至靶组织部门给药；

（4）遵循的律例分歧，mRNA疫苗必要遵循疫苗的领导准则，免疫原性属于其PD指标，而医治性药物则分歧的遵循，免疫原性也非是研发者所进展。

mRNA疫苗能够在细胞内表白病毒或细菌蛋白，刺激机体产生免疫；ば钥固，或者表白肿瘤新生抗原，从而造备个性化肿瘤疫苗。部门mRNA疫苗如针对基因突变产生的肿瘤新生抗原开发的疫苗，能够被以为是基因医治产品。但另一部门mRNA疫苗表白病毒抗原如新冠疫苗可直接表白SARS-CoV-2的刺突蛋白或刺突蛋白的RBD结构域，诱导机体产生免疫应答，通常不以为是基因医治产品，故如前所述只是部门mRNA产品属于基因医治领域。

mRNA疫苗临床前PK/PD调查分析的身分重要有：

（1）预防用生物制品的领导准则中指出疫苗通常不必要进行通例的药代动力学钻研，但某些特殊类型疫苗应必要进行生物散布的钻研；

（2）非临床钻研中，必要钻研mRNA和脂质纳米颗粒（LNPs）或其它脂质成分是否在接种疫苗的组织平散布，它们散布在哪些组织中，以及它们的持续功夫。

（3）作为疫苗通常不用分析表白产品，但其表白产品的免疫原性相当于其沉要的药效指标。

基于mRNA疫苗的机造和成效，对于免疫原性方面，既要思考结合抗体又要思考中和抗体，不仅思考B细胞免疫还要思考细胞免疫（拜见图4），与医治性药物相比，mRNA疫苗的免疫原性很强，通常不必要使用高成本高活络的检测技术进行结合抗体的检测。

图4. mRNA疫苗作用机造示意图

mRNA医治性药物有如下效用方式：

（1）抗体效用，即直接表白用于医治当前和新发疾病的预防性或医治性抗体；

（2）蛋白代替疗法，即直接表白一种人类蛋白来解决遗传疾病，如血友；

（3）基因编纂/碱基编纂，即表白基因组编纂蛋白或碱基编纂蛋白来建饰人类基因表白。

mRNA医治性药物通过编码职能性医治蛋白，由所表白的蛋白产品阐扬医治作用。该类药物的临床前PK/PD分析必要有以下两个思考点：

（1）PD的持续与mRNA产品的表白量和表白时相有关，即存在肯定的量效关系；

（2）药物的PK钻研如吸收和散布的钻研有利于评价量效关系。

mRNA医治性药物的临床前PK/PD分析必要考查的身分有：

（1）PK分析：即mRNA浓度随功夫变动的分析；

（2）将表白产品，即指标蛋白的表白量与散布作为PD指标进行分析；

（3）脂质体成分的药代散布分析，尤其是新型脂质辅料。

此表，PK/PD与免疫原性间通常拥有关联性，对于mRNA医治性药物必要同时辰析mRNA自身和脂质体成分的免疫原性影响，聚乙二醇化LNP产生抗体已有报路，抗PEG抗体已被宽泛钻研和报路，笔者地点机构也分析出LNP的PEG成分可见肯定水平的免疫原性，笔者地点机构表白IgG1亚型抗体的医治性mRNA产品在食蟹猴静脉给药的PK/PD试验例中全面两全了本文所列重点。

图5. mRNA医治性药物的PK/PD钻研设计执行例

Part.3

寡核苷酸类产品的PK/PD考量

目前寡核苷酸类产品成药上市的重要为反义寡核苷酸（ASO）与siRNA，而miRNA研发进入临床试验的极少，所以本部门的分析仅以ASO与siRNA药物为代表。ASO和siRNA的重要区别在于，前者是单链，后者是双链RNA。而双链的siRNA作用机造与RISC形成有关，RISC可反复作用靶标mRNA； siRNA被开释的正义链或被降解，也可作为引物，在RNA依赖的RNA聚合酶的催化下以靶mRNA为模板扩增得到dsRNA，dsRNA又可被Dicer降解成siRNA，进入RNAi循环，所以药物成效更悠久甚至有级联放大成效。

寡核苷酸类药物的PK特点蕴含：

（1）静脉给药和其它蹊径给药，药物进入靶部位的方式分歧，导致体内的PK过程也不一样；

（2）裸siRNA不不变，易被血液和组织中核酸酶降解；

（3）容易在肝脏和肾脏中荟萃，并经肾脏渗出；

（4）非脑内给药时，不易过脑；

（5）两条链被建饰的方式不一样，导致两条链的PK参数好比峰浓度和露出量不一致；

（6）在给药部门存留功夫长；

（7）血液断根速度要快于组织；

（8）目前的药物根基都为体表合成的RNA分子，可被免疫系统吞噬，有些还会激活天然免疫，如toll样受体参加引发免疫反映，好比滋扰素（IFN-α、IFN-β)、细胞因子（TNF-α、IL-6）产生等。寡核苷酸药物重要经核酸内或表切酶代谢为短核苷酸碎片，和蛋白类药物被蛋白酶切割降解为氨基酸类似，所以寡核苷酸药物与传统大分子药物的代谢上有雷同之处，但很多寡核苷酸现实又多见建饰，其代谢产品分析仍需周全思考；另其分子量是弘远于幼分子和一些多肽，分子量较大，必要思考免疫原性潜在的对其PK/PD特点的影响。

寡核苷酸类药物PK/PD调查分析的战术重点重要蕴含：

（1）依照幼分子药物PK钻研思路设计有关钻研内容；

（2）两全其大分子药物的部门特点，思考免疫原性的影响，如抗药物抗体（ADA）的分析，思考代谢断根缓慢的特点；

（3）对于siRNA，分析反义链和有义链所表征的PK行为是否有差距；

（4）必要时，把稳调查造剂辅料的PK特点；

（5）设置相应PD指标，如新职能蛋白的水平变动;

（6）适当设置细胞因子、补体等PD生物标志物指标，针对辅料如PEG的抗体检测;

（7）利用相宜平台技术开发满足现实活络度需要且不变的PK生物分析步骤是一大挑战。

分析寡核苷酸类药物的PK/PD，离不开对其免疫原性的察。由于寡核苷酸类药物是表源性核酸分子，分子量偏大，并且是潜在的弱抗原或半抗原。而免疫原性产生的重要原因可能与其产品成分、产品的药理学成分以及给药对象成分有关，药理学成分以及给药对象成分具体机造与其它大分子的这两方面成分大体一样，沉点要思考该类产品潜在引起免疫原性的自身的产品成分的分歧如链型、碱基序劣注碱基建饰、递送载体成分、骨架建饰等。免疫原性的调查点的思考基于siRNA等寡核苷酸的表源性性质，宿主系统会将其视为病原体，免疫系统能够通过细胞表和细胞内分歧的病原有关分子模式（PAMP）受体鉴别单链和双链RNA与toll样受体（TLRs）相互作用产生免疫应答；以及TLRs刺激炎症细胞因子和I型滋扰素（IFN）的过量产生的免疫反映。既要思考体液免疫分析，又要思考除寡核苷酸自身表的载体成分，甚至药效机造阐扬而天生的新的职能性蛋白成分的免疫原性。

Part.4

分析战术与技术利用

核酸类药物尤其是寡核苷酸类药物，对生物分析带来了巨大的挑战。寡核苷酸类药物的分子量不大不幼、并存在药物不不变、链型、建饰、弱免疫原或半抗原（导致特异阳性抗体的造备存在现事阀难）等特点，这些都是组成其分析挑战的几大成分。

目前重要有5种主流技术能够进行核酸类药物的PK分析，蕴含PCR技术、H-LBA、b-DNA、基于杂交的LC-UV/PL以及LC-MS/MS和LC-HRMS（图6）。

其中，qPCR技术能够方便地检测长度较长的核酸类药物，活络度高，检测领域宽，但是必要复杂的样品处置过程；ddPCR活络度更高，但耗材用度高，成本高；对于较短的核酸检测来说，固然也能够通过茎环qPCR（Stem-Loop qPCR）的设计实现，执行相对于较大的核酸要复杂。H-LBA步骤的特异性高，活络度好，但是检测成效极度依赖于探针的靠得住性和设计技巧及反映过程细节的优化；b-DNA步骤其实是H-LBA技术的拓展版，有很高的特异性、正确性和更高的活络度，但检测成效同样高度依赖于特殊的探针设计及杂交反映技术细节；基于杂交的LC-UV/FL步骤能够测定较长核酸类药物，具备较好的特异性和正确性，但是样品处置复杂，活络度对荧光探针的正确性高度依赖；LC-MS/MS和LC-HRMS步骤也能够用于核酸类药物的分析，选择性好，能够分辨全长和代谢产品，但是对非建饰的寡核苷酸类药物检测活络度和特异性相对较差，并且价值昂贵，不合适测过长的核酸分子。其它的活体荧光成像，同位素示踪、原位杂交、荧光原位杂交等分析技术能够作为补充伎俩，利用于分歧的主张和钻研阶段，但它们的精准度差，不大适合作为后续的验证用步骤。

图6. 核酸类药物生物分析的主流技术对比

总结

近年来，核酸类药物是近几年来最热点一大新药钻研方向。但核酸类药物尤其是寡核苷酸类药物与传统幼分子与大分子药物成分存在显著区别，给核酸类药物的生物分析和PK/PD调查带来了较大的技术挑战。mRNA药物作为疫苗和医治性药物时思考点分歧，寡核苷酸类药物同时两全了大幼分子的一些PK/PD特点，必要凭据具体的分子特点选择PK/PD调查评估战术和分析的技术利用战术。

[1]. Sun, H., et al., mRNA-Based Therapeutics in Cancer Treatment. Pharmaceutics, 2023. 15(2).

[2]. Takakusa, H., et al., Drug Metabolism and Pharmacokinetics of Antisense Oligonucleotide Therapeutics: Typical Profiles, Evaluation Approaches, and Points to Consider Compared with Small Molecule Drugs. Nucleic Acid Therapeutics, 2023.

[3]. Munter, R., et al., Studying how administration route and dose regulates antibody generation against LNPs for mRNA delivery with single-particle resolution. Mol Ther Methods Clin Dev, 2023. 29: p. 450-459.

[4]. Mu, R., et al., Bioanalytical Methods and Strategic Perspectives Addressing the Rising Complexity of Novel Bioconjugates and Delivery Routes for Biotherapeutics. BioDrugs, 2022. 36(2): p. 181-196.

[5]. Nonclinical Testing of Individualized Antisense Oligonucleotide Drug Products for Severely Debilitating or Life-Threatening Diseases; Draft Guidance for Sponsor-Investigators; Availability. 2021, Federal Information & News Dispatch, LLC: Washington. p. 22213.

[6]. Krienke, C., et al., A noninflammatory mRNA vaccine for treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. Science, 2021. 371(6525): p. 145-153.

[7]. Bioanalytical Methods and Strategic Perspectives Addressing the Rising Complexity of Novel Bioconjugates and Delivery Routes for Biotherapeutics.

[8]. Hirabayashi, Y., et al., Considerations of the Japanese Research Working Group for the ICH S6 & Related Issues Regarding Nonclinical Safety Assessments of Oligonucleotide Therapeutics: Comparison with Those of Biopharmaceuticals. Nucleic Acid Therapeutics, 2021. 31(2): p. 114-125.

[9]. 预防用生物制品临床前安全性评价技术审评通常准则.NMPA, 2005.

[10]. 医治用生物制品非临床安全性评价领导准则.NMPA, 2007.

[11]. 彭双清，郝卫东. 药物安全性评价关键技术[M]. 北京: 军事医学科学出版社, 2013.

[12]. Evaluation of the quality, safety and efficacy of messenger RNA vaccines for the prevention of infectious diseases: regulatory considerations. WHO, 2021.