编者引言：单克隆抗体药物进入体内有着多个可能的存在大局：游离型、部门结合型、齐全结合型？固逡┪锾迥诘亩嘀执嬖诖缶质沟闷銹K分析步骤学设计较为复杂，若何思考待测分子大局，若何针对性地设计出相宜的Assay Format，实际中又可能出现什么样的问题和挑战，在本文中作者将进行具体论述。下面就随着幼编一路往下看吧！

当前生物医治性产品中抗体药物占重要部门，截至2017年，已经有60多个单抗药物获批上市，2017年全球销售额排名前10的药中，有8个是大分子药物，这8个中单抗药就占6个，目前超500种抗体药物处于临床开发阶段，国内表抗体药物开发的热度近几年来持续上升。这些抗体产品根基上都是IgG亚型的单克隆抗体。IgG是拥有两个抗原结合价的抗体亚型，这种二价性使得抗体药物在体内有多种可能的存在大局：二价的即游离型抗体（mAbfree），单价的即部门结合的抗体（Partial bound mAb），结合了两个抗原的抗体即齐全结合的抗体(Total bound mAb)。在进行血药浓度检测时，必要思考是否有循环的、可溶性的抗体药物靶向结合的配体分子(Ligand,L)存在，从而明确其多种可能的存在大局。若是抗体药物靶向结合的配体是一个二聚体甚至多聚体，抗体药物的存在大局可能更为复杂。鉴于抗体药物体内存在大局的多样性，靠得住的分析步骤学是支持PK/PD钻研，评估剂量-反映关系，评价有效性和安全性的关键。

利用抗体的靶向配体分子即靶点分子作为捕获试剂，以抗Human IgGFc的抗体作为检测试剂的配对夹心模式是一种较为方便和节约的Assay Format设计（拜见图1）。这种Assay Format能够检测两种状态的抗体药物，即部门结合的抗体（Partial bound mAb）与游离抗体(mAbfree)，但不能检测到齐全结合的抗体，因而无法定量mAbtotal。若指标基质中明确不成能存在游离靶点的滋扰或mAb*L复合物，使用此种Assay Format进行PK检测简直是一种方便的蹊径，且此时检测抗体大局也仅可能是游离抗体（mAbfree）。游离靶点的存在，和给药后mAb*L复合的形成，靶点的蓄积会滋扰此Assay Format对mAbtotal的检测，但有钻研人员提出将mAb*L酸化解离的步骤使所有结合型mAb造成游离的大局，从而达到基于此Assay Format能检测mAbtotal的主张。也有钻研人员将此步骤进行刷新，即选取包被有Streptavidin的固相资料，并将用于捕获的靶点分子进行Biotin象征与酸化处置的样品同步参与反映系统中达到尽可能定量mAbtotal的主张，这样的操作流程类似于ADA检测的Bridge ELISA检测模式（拜见图２）。

    图1：靶点捕获测游离与部门结合的抗体

    图2：基于图一的刷新型靶点捕获法

抗怪异型单克隆抗体是一种可能鉴别、结合另一抗体可变区的抗体，在抗体药物的药代动力学分析上有较多的利用。在某一个特定的抗体分子中，其可变区中特异性的抗原表位部门，被称为抗体的怪异位（idiotope）。对于某一个特定的抗体，存在着多个怪异位区域：有些怪异位和该抗体的抗原结合互补位齐全沉合；有些怪异位位于可变区的互补位之表；而另表一些怪异位，除了互补位之表，还蕴含了可变区上其它序列。一个抗体分子中所有怪异位和互补位统称为该抗体的怪异型（拜见图３）,针对于某一个抗体分子怪异型部门的抗体，被称为抗怪异型抗体（Anti-idiotype Atibody，Anti-id）。与抗原结合互补位结合的抗怪异型抗体拥有抑造性或中和性，不与抗原互补位结合的抗怪异型抗体不拥有抑造性和中和性。选取分歧的抗怪异型抗体设计出分歧的Assay Format能够针对性地检测到各类大局的单克隆抗体药物，即游离、部门结合或齐全结合抗原的单克隆抗体。

    图3：抗体的怪异型与怪异位

以非抑造性的抗怪异型抗体(Non-inhibitory Anti-id)作为捕获试剂，并以非抑造性的抗怪异型抗体或抗Human IgGFc抗体（Anti-Hu Fc）作为检测试剂能够检测所有的抗体大局（mAbtotal）(拜见图４,图5)。以抑造性抗体(Inhibitory Anti-id) 或靶点分子别离作为捕获试剂、检测试剂配对模式构建桥式ELISA（Bridge ELISA），甚至靶点分子和抑造性抗体(Inhibitory Anti-id)配对使用可实现仅能检测到游离型抗体药物。（拜见图6）。以抑造性的抗怪异型抗体捕获试剂，非抑造性的抗怪异型抗体(Non-inhibitory Anti-id)或抗Human IgGFc抗体（Anti-Hu Fc）作为检测试剂能够检测游离和部门结合的单价抗体（拜见图7）。将抑造性的抗怪异型抗体或靶点分子作为捕获试剂，选取象征mAb药物与样品中非象征mAb药物竞争结合固相抗体的步骤也能够检测游离和部门结合的单价抗体，将此种步骤的捕获试剂代替为非抑造性的抗怪异型抗体也能够检测总的抗体药物（mAbtotal），但竞争性的步骤更较作难以获得好的稳重性。

    图4：基于Non-inhibitory Anti-id和抗Hu IgGFc抗体（Anti-Hu Fc）检测mAbtotal

    图5：基于Non-inhibitory Anti-id作为捕获和检测试剂检测mAbtotal‘’

    图6：基于靶抗原分子配对作为捕获和检测试剂检测mAbfree

    (注明:设计时将图中的捕获抗原和检测抗原换成抑造型抗怪异型抗体，或其中一个抗原代替为抑造性抗怪异型抗体均可实现仅检测mAbfree ，不再逐一图示)

    图7：以抑造性和非抑造性抗怪异型抗体别离为捕获和检测试剂检测mAbfree和单价抗体

对于结合型抗体药物（部门结合和齐全结合）的检测，也能够选取与抗体药物不具竞争性的抗靶点的抗体作为捕获试剂，以非抑造性的抗怪异型抗体(Non-inhibitory Anti-id)或抗Human IgGFc抗体（Anti-Hu Fc）作为检测抗体的组成的Assay Format进行检测（图8）。也有文件指出，在样品中增长过量的游离靶向配体分子将mAb转造成mAb*L从而尽可能实现此Assay Format对mAbtotal的定量。

    图8：以非抑造性抗靶点抗体为捕获试剂检测齐全结合和部门结合抗体

前述分歧Assay Format中的检测抗体能够凭据活络度必要或检测模式的必要将HRP象征代替为其它分歧的分子进行象征。固然分歧的Assay Format能够针对性地实现PK样品中分歧抗体药物大局的检测，但在实际中依然可能面对很多挑战和问题值得思虑。1）如抗怪异型抗体固然能够较好地利用于PK生物分析中，但其造备和筛选有肯定的周期和难度，越发亏损成本。2）酸化解离和将游离mAb转化为mAb*L虽能够将对mAb部门状态检测的Assay format利用于mAbtotal的检测分析，但酸化后的样品在参与中和液后脱节离的靶点分子还是可能与用于捕获的靶点分子进行竞争，因而给操作上增长了节造难度，解离后的复合物存在着又结合回去的可能，酸化是一种推进检测步骤对游离靶点的耐受性伎俩，但用于定量检测的正确性还必要看步骤的优化水平；抗原抗体反映拥有可逆性，是一个动态平衡的过程，而游离mAb即便在过量的靶向配体分子存鄙人也不成能全数转化为mAb*L，此过程对mAbtotal定量的误差水平必要有效节造在肯定的领域内，有其实际中的复杂性。3）实际中我们首先或更容易获得的配造PK样品分析尺度曲线的是mAbfree，游离的尺度品造备的尺度曲线在定量检测结合型抗体齐全相宜吗？含有与游离mAb尺度品等摩尔浓度或等质量浓度的抗体分子成分的mAb*L复合物在检测过程中的反映能力和产生的信号强度一致吗？是不是必要进行两者的间的校对或要另表造备mAb*L复合物尺度品呢？

另表，若是靶点配体分子与药物结合表还可能与其它分子结应时，步骤上若何设计和优化；若是靶点分子是二聚体或多聚体又会对PK分析产生什么样的挑战；抗体药物作为大分子药物拥有潜在的免疫原性，这又会对PK分析产生什么样的影响等等没有列入此文的会商领域。随着各学科的发展，新的检测技术出现和实际的深刻，未来对各类状态的抗体分子检测会越发游刃有余。

• 【云讲堂】理论、律例、实际，三位一体解说双抗的生物分析

• 【云回首】理论、律例、实际，三位一体解说双抗的生物分析

• 【云讲堂】多肽类药物生物分析的挑战与对策

• 【云回首】若何做好多肽类药物的生物分析？

Email: marketing@medicilon.com.cn
电话: +86 (21) 5859-1500（总机）