一、蛋白质表白与纯化尝试道理

（一）利用大肠杆菌表白进行原核表白

基因工程的最终主张是在一个相宜的系统中，使表源基因高效表白，从而出产有价值的蛋白质产品。

1.原核生物基因表白的特点

（1）原核生物（如大肠杆菌）只有一种RNA聚合酶，鉴别原核的启动子，可能催化所有RNA合成。

（2）原核生物的基因表白是以把持子为单元。把持子是数个有关的结构基因及其调控区的结合，是一个基因表白的协同单元。

（3）由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是耦联的，二者也是陆续进行的。原核生物染色体DNA是袒露的环型DNA，转录成mRNA后，可直接在胞浆中与核糖体结合翻译成蛋白质。每个核糖体可独立实现一条链的合成，多核糖体可同时在一条mRNA合成多条肽链，大大提高了翻译效能。

（4）原核基因不含内含子（intron），没有转录后加工过程。

（5）原核生物基因表白的节造重要是在转录水平。对RNA合成的调控有两种方式：启始节造（启动子节造）和终止节造（衰减子节造）。

（6）在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，有一个转译启始密码子及同16S核糖体RNA 3′结尾碱基互补的序列，即SD序列，真核基因则无此序列。

2.表源基因在原核中表白的关键

（1）表白载体将表源基因导入宿主菌，领导宿主菌的酶系统合成表源蛋白；

（2）表源基因不能带有内含子；

（3）利用原核细胞的强启动子和SD序列等节造表源基因的表白；

（4）表援基因与表白载体衔接后，必须形成正确的盛开阅读框架；

（5）利用宿主菌的调控系统，调节表源基因的表白，预防表白的表源基因产品对宿主菌的毒害。

3.表源基因在原核细胞中表白的沉要调控元件

（1）启动子

-35区：位于转录启始位点上游35bp处，通常由10bp组成，与RNA聚合酶δ亚基结合；

-10区（TATA box）：位于转录启始位点上游5-10bp处，通常由6-8bp，富含A T，与RNA聚合酶的主题酶结合。

原核表白载体所用的启动子必须是原核启动子，通常所用的可调控的强启动子有：lac（乳糖启动子）、trp（色氨酸启动子），λPL（λ噬菌体左向启动子），Tac（乳糖和色氨酸的杂和启动子）等。

（2）SD挨次

mRNA在细菌中转译率严格依赖于SD序列以及SD序列与启始密码子AUG之间的距离，例如，当lac启动子的SD序列距AUG为7个核苷酸时，IL-2表白最高，为2581单元，而距离8个核苷酸时，表白水平降到不及5个单元。另表某些蛋白质与SD序列结合也回影响蛋白质的翻译。

（3）终止子（terminator）

4.原核表白载体的类型

（1）非融合型

不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一路的表白蛋白。

利益：极度靠近于生物体内天然蛋白质；

弊端：容易被细菌蛋白酶粉碎，未知蛋白难于纯化。

（2）融合型

蛋白质的一端由原核DNA序列或其它序列编码，另一端由真核DNA的齐全序列编码。

利益：应该预防细菌蛋白酶的粉碎，由于融合部门的关系，常易于表白产品的分离纯化。

弊端：由于细菌的一段蛋白或多肽的存在，有时会影响其结构，需去掉。

5.用于原核细胞表白的表源基因

由于原核细胞不足真核细胞转录后的加工系统，mRNA的内含子不能切除，成熟的mRNA不能形成，同时原核细胞也不足真核细胞翻译后的加工系统。只能用cDNA而不能用基因组DNA，或体表合成基因，PCR扩增基因等。

（二）利用HIC树脂纯化ZsGreen蛋白

甲基化疏水反映层析（HIC）树脂是利用疏水基团进行分离蛋白的一种单一而有效的步骤。结合缓冲液中的Cl-倾轧带负电荷的ZsGreen分子的β-表壳，这种倾轧使分子内部表翻，露出疏水基团。露出的疏水基团牢牢与HIC树脂的非极性甲基基联结合；中性盐洗脱使ZsGreen维持为疏水状态；但是能够洗脱未结合或者是结合弱的蛋白；低盐缓冲液使疏水基团回到ZsGreen分子的原来地位，从而使ZsGreen分子HIC树脂中开释。

（三）SDS-PAGE分析

聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，拥有分子筛效应，它有两种大局，一种长短变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中维持齐全的状态，蛋白在其中依三种成分分隔：蛋白大幼，状态和电荷。而SDS-PAGE仅凭据蛋白分子量亚基的分歧而分离蛋白。这个技术首先是1967年由shapiro成立，他们发此刻样品介质和丙烯酰胺凝胶中参与离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁徙率重要取决于亚基分子量的大幼，电荷成分能够忽视。

SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，粉碎蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中参与还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白——SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量，这样就解除了分歧分子间的电荷差距和结构差距。SDS-PAGE通常选取的是不陆续缓冲系统，于陆续缓冲系统相比，可能有较高的分辨率。

浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较幼，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁徙作用而被浓缩至一个狭幼的区带。当样品液和浓缩胶选Tris-HCl缓冲液，电极液选Tris-甘氨酸。电泳起头后，HCl解离成Cl-，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因而一路向正极移动，其中Cl-最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳起头时Cl-泳动率最大，超过蛋白，因而在后面形成低电导区，而电场强杜纂低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以不变的界面，使蛋白荟萃在移动界面左近，浓缩成一中央层。

本尝试中，我们首先提取大肠杆菌（E.coli）基因组，PCR扩增冷激蛋白CspA的启动子、上游调控及下游5′-UTR区序列，得到cspA1、cspA2和cspA3，在两端引入酶切位点；用限度性内切酶切割质粒pZsGreen1-1，得到绿色荧光蛋白ZsGreen汇报基因；以pET-28a（+）为骨架，酶怯注衔接，构建含冷激启动子、汇报基由于ZsGreen的表白载体pCspA1-ZsGreen、pCspA2-ZsGreen、pCspA3-ZsGreen（图1）及对照常温表白载体pT7-ZsGreen（图5-1）。

二、尝试仪器及药品 （1）STE的配造（表3-1）

表3-1STE（100mL）配方

在60mL dH2O中参与5mol/L NaCl 2mL、1mol/L Tris-HCl（pH8.0） 1mL和0.5mol/L EDTA（pH8.0）200μL，混匀，加dH2O定容至100mL，1.034×105Pa高压蒸汽灭菌15min，备用。配造好的STE含有0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA。

（2）溶液I的配造（表3-2）

表3-2溶液I（100mL）配方

60mL dH2O中参与0.9g葡萄糖、1mol/L Tris-HCl（pH8.0） 2.5mL和0.5mol/L EDTA（pH8.0）  2mL，混匀，加dH2O定容至100mL，1.034×105Pa高压蒸汽灭菌15min，4℃贮存。配造好的溶液I含有50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl和10mmol/L EDTA。

（3）溶液II的配造（表3-3）

溶液II中含有0.4mol/L NaOH和1% SDS，该试剂必要新鲜配造，配造后将NaOH和SDS按1：1的比例混合。

表3-3溶液II（1mL）配方

（4）溶液III的配造（表3-4）

表3-4溶液III的配造（100mL）

配造好的溶液III含3mol/L KAc、5mol/L冰醋酸（pH4.8）。

三、质粒抽提尝试步骤

质粒提取过程如下：

（1）将琼脂造就板上的阳性单菌落，移至3mL LB液体造就基中（含Amp或Kana），或将大肠杆菌的甘油菌按1：30的比例接到LB液体造就基中，37℃剧烈摇曳造就过夜；

（2）取500μL菌体，与40%甘油等体积混合，-70℃保留，渣滓的菌体用于质粒的提；

（3）取出1.5-2mL菌液移至Eppendorf管中，12000rpm，4℃离心30s，弃上清，用1mL    STE悬浮菌体沉淀，洗涤菌体，再离心回收菌体；

（4）再沉复用STE漂洗菌体，离心后，去尽上清液；

（5）将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中，强烈振荡混匀；

（6）参与200μL新配造的溶液II，轻轻颠倒离心管5次以混合内容物，不要强烈振荡，搁置冰上3min左右（凭据分歧菌株，可适当缩短）；

（7）参与150μL冰预冷的溶液III，轻轻颠倒5次，混匀，置于冰上5min；

（8）15000rpm，4℃离心5min，将上清转移到另一个离心管中；

（9）向上清中参与等体积的酚：氯仿（1：1），混匀，15000rpm离心5min，将上清转移到另一个离心管中；

（10）参与2倍体积冰预冷的无水乙醇，室温搁置2min，沉淀双链DNA；

（11）15000rpm，4℃离心5min；

（12）倒掉上清，使液体尽量流尽，空气中干燥沉淀；

（13）用20μL含有RNaseA的TE缓冲液溶化核酸沉淀，瞬时离心，混匀，贮存于-20℃冰箱中备用。

四、尝试了局

（一）未纯化SDS-PAGE分析

将含有pCspA1-ZsGreen、pCspA2-ZsGreen、pCspA3-ZsGreen的大肠杆菌（E.coli），在16℃表白；含有pT7-ZsGreen的大肠杆菌（E.coli）在37℃下表白至OD600＝0.6时，参与IPTG诱导表白，不加IPTG诱导的作为对照。诱导表白5h后网络菌体，进行SDS-PAGE分析（图5-2）。

图5-2中，M为低分子量蛋白Maker。1-5别离为pT7-ZsGreen（IPTG-，37℃）、pT7-ZsGreen（IPTG+，37℃）、pCspA1-ZsGreen（16℃）、pCspA2-ZsGreen（16℃）、pCspA3-ZsGreen（16℃）表白ZsGreen。箭头所示为ZsGreen，其大幼约为27KD。SDS-PAGE了局显示：三种低温诱导表白载体pCspA1-ZsGreen、pCspA2-ZsGreen、pCspA3-ZsGreen在16℃下表白ZsGreen正常，可用作下一步对其翻译效能的分析。

（二）纯化后SDS-PAGE分析

将含有低温诱导表白载体pCspA1-ZsGreen、pCspA2-ZsGreen、pCspA3-ZsGreen的大肠杆菌（E.coli），在16℃下表白，以1h为功夫距离网络菌体，利用HIC树脂纯化ZsGreen蛋白，进行SDS-PAGE分析（图5-3）。

图5-3中，M为低分子量蛋白Maker。A1-7、B8-14、C15-21别离为pCspA1-ZsGreen、pCspA2-ZsGreen、pCspA3-ZsGreen 16℃表白4h HIC纯化后SDS-PAGE。箭头所示为ZsGreen，其大幼约为27KD