为什么蛋白纯化如此沉要
？

蛋白质的分离与纯化过程较为复杂
。从细胞中提取的蛋白质，或通过沉淀、梯度离心、盐析等步骤从蛋白质溶液中获得的蛋白质，通常仍含有肯定杂质
。为了去除这些杂质，同时维持蛋白质的生物学活性（如酶的催化活性），必要凭据分歧蛋白质的性质造订相应的纯化战术，并选取分歧的分离纯化步骤
。电泳法和色谱法是较为常用的技术，其中色谱法对蛋白质作用较为和善，且可能大量造备拥有生物学活性的高纯度蛋白质，因而已成为目前利用最宽泛的分离纯化技术
。

1、蛋白沉淀

蛋白质能溶于水是由于其表表散布有亲水性氨基酸残基
。在蛋白质的等电点左近，若溶液离子强度出格低，蛋白质容易从溶液中析出
；此表，通过参与高浓度盐使离子强度显著升高，也可导致蛋白质沉淀（盐析）
。

硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，由于它在冷的缓冲液中溶化性好，冷的缓冲液有利于维持主张蛋白的活性
。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它能够初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分
。蛋白质在硫酸铵沉淀中较不变，能够短期在这种状态下保留中央产品，当前蛋白质纯化多选取这种法子进行粗分离
。但是在规
；霾，硫酸铵沉淀步骤仍存在一些问题：硫酸铵对不锈冈祺具的侵蚀性很强
。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化成效不如硫酸铵
。

除盐析表，蛋白质也可通过多聚物（如PEG、防冻剂）沉淀
。PEG（聚乙二醇）是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有不变成效，在缓慢搅拌下逐步提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下持久保留而不败坏
。

蛋白沉淀对蛋白纯化而言并非梦想步骤，由于它通常只能达到几倍的纯化成效，而指标纯化往往必要上千倍的纯化倍数
。其优势在于能将蛋白质从含有蛋白酶及其他有害杂质的造就基或细胞裂解物中分离出来
。

2、缓冲液的更换

固然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但其在蛋白纯化规划中仍拥有沉要作用
。分歧的蛋白纯化步骤必要分歧pH值及分歧离子强度的缓冲液
。若用硫酸铵将蛋白沉淀出来，蛋白无疑处于高盐环境中，需进行脱盐处置

？衫冒胪改ね肝，通过频仍更换透析液去除盐分，但该步骤耗时较长（通常需数幼时至过夜），且难以用于大规模纯化

新型的设备将透析膜夹在两个板中央，在板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，能够使两侧溶液在数幼时内达到平衡，若增长对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的主张
。

此表，市售脱盐柱也可用于此主张，柱内填料为幼孔径颗粒，蛋白分子无法进入孔内，因而吓宗高浓度盐离子从柱中流出，实现二者分离

蛋白纯化的每一步城市导致主张蛋白迷失，缓冲液平衡的步骤尤为严沉
。蛋白会结合在职何它能接触的表表上，剪切力、起泡沫以及离子强度的急剧变动很容易让蛋白失活
。

3、离子互换色谱

离子互换层析是蛋白纯化中最有效的步骤之一

；诘鞍字视肜胱踊セ皇髦涞木驳缦嗷プ饔，通过选择分歧pH的缓冲液，统一种蛋白质既能够与阴离子互换树脂（结合带负电荷的分子）结合，也能够与阳离子互换树脂结合
。树脂常用的职能基团有四种：二乙基氨基乙基（DEAE）用于弱阴离子互换树脂
；羧甲基（CM）用于弱阳离子互换树脂
；季铵（Q）用于强阴离子互换树脂
；甲基磺酸酯（S）用于强阳离子互换树脂
。蛋白质由氨基酸残基组成，其在分歧pH环境下的净电荷分歧
。大无数蛋白在生理pH领域（pH 6～8）内带负电荷，因而需选取阴离子互换柱纯化
；在极端pH前提下蛋白易变性失活，应尽量预防
。

由于在特定pH下分歧蛋白所带电荷数分歧，与树脂的结合力也存在差距，通过增长缓冲液中盐浓度或扭转pH，蛋白可按结合力强弱顺次被洗脱
。在工业化出产中通常扭转盐浓度而非pH值，由于前者更易于节造
。在尝试室中险些总是选取盐浓度梯度洗脱离子互换柱，借助泵可使流入柱内的缓冲液盐浓度安稳上升，当离子强度足以屏蔽蛋白电荷时，蛋白即从柱上洗脱下来
。但在工业出产中盐浓度难以精确节造，因而常用分步洗脱而非陆续升高的盐浓度梯度
。与排阻层析相比，离子互换层析选择性更好，有更多参数可调整以获得最优纯化成效，且树脂成本较低
。

值得一提的是，即便在前提节造最精确的情况下，仅依附单一的离子互换步骤也无法获得纯蛋白，仍需结合其他纯化步骤
。

4、亲和层析

亲和层析基于主张蛋白与固相化配基之间的特异性结合而使主张蛋白滞留，其他杂蛋白则直接流过柱子
。本步骤存在的问题是：单抗极度昂贵，且自身也需先纯化
；单抗与主张蛋白结合力过强，需选取刻薄前提洗脱，这会导致主张蛋白失活并粉碎单抗
；混合物中的蛋白酶等杂蛋白也可能粉碎抗体或与其非特异性结合
；某些单抗还可能在纯化过程中从树脂上脱落并混入产品，这些脱落的抗体也需从终产品中去除
。亲和柱通常在纯化过程的后期使用，此时样品体积已缩幼，大部门杂质已经去除
。

谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione S-transferase，GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有该标签的沉组蛋白可用谷胱甘肽交联的层析介质纯化，但本步骤存在以下弊端：首先，蛋白上的GST必须正确折叠，形成能与谷胱甘肽结合的空间结构，方可选取此步骤纯化
；其次，GST标签多达220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表白蛋白的可溶性，易导致宽恕体的形成，从而粉碎蛋白的天然结构，难以进行结构分析，有时即便在纯化后酶切去除GST标签也不愿定能解决问题
。

另一种常用的亲和纯化标签是6组氨酸标签（His-tag），组氨酸的咪唑侧链可结合镍、锌、钴等金属离子，在中性和弱碱性前提下带组氨酸标签的主张蛋白可与镍柱结合，通过提高咪唑浓度进行竞争洗脱
。与GST相比，组氨酸标签拥有诸多利益：首先，由于仅有6个氨基酸，分子量很幼，通常无需酶切去除
；其次，可在变性前提下纯化蛋白，在高浓度尿素和盐酸胍中仍能维持结合力
；另表，6组氨酸标签无免疫原性，沉组蛋白可直接用于动物免疫，也不影响免疫学分析
。

只管His-tag拥有上述利益，沉组蛋白表白过程中仍可能出现主张蛋白形成宽恕体、难以溶化、不变性差及谬误折叠等问题
。此表，镍柱纯化也存在缺点：金属镍离子容易脱落并混入蛋白溶液，不只可能通过氧化作用粉碎主张蛋白的氨基酸侧链，并且柱子也会非特异性吸附蛋白质，影响纯化成效
。除上述标签表，若主张蛋白可与某种碳水化合物特异性结合，或必要某种特殊辅因子，可将该碳水化合物或辅因子固相化造成亲和柱，结合后主张蛋白可用高浓度的碳水化合物或辅因子洗脱
。

5、疏水作用

蛋白质由疏水性氨基酸和亲水性氨基酸组成
。通常情况下，疏水性氨基酸位于蛋白质空间结构的内部，远离表表的水分子
；而亲水性氨基酸残基则散布于蛋白表表
。由于亲水性氨基酸可能吸引大量水分子，因而蛋白质分子通常被水化层包抄，内部的疏水区域不会露出于表界
。

在高盐浓度前提下，蛋白质表表的水化层被减弱，疏水区域逐步露出，并与疏水介质表表的疏水性配基产生相互作用
。分歧蛋白质的疏水性水平分歧，其与疏水配基之间的结合力也存在差距
。通过逐步降低缓冲液中的盐浓度，能够减弱蛋白与疏水配基之间的相互作用，使蛋白质复原天然构象并从层析柱中洗脱下来
。

疏水作用层析介质的选择性重要由疏水性配基的结构决定
。常用的配基蕴含直链烷基配基（alkyl ligands）和芳香基配基（aryl ligands）等，通常情况下，配基链越长，其与蛋白的结合能力越强
。梦想介质的选择应凭据指标蛋白的化学性质确定，不宜选择结合力过强的树脂，不然会导致蛋白难以洗脱
。因而，在步骤开发初期，通常先选取结合力适中的苯基树脂进行前提筛选
。

为了便于筛选相宜的介质，Amersham Biosciences推出了疏水作用层析树脂筛选试剂盒，其中蕴含5种分歧类型的树脂供比力选择
。疏水作用层析出格适合作为离子互换层析后的下一步纯化工艺，由于该技术必要在高盐前提下上样，而离子互换层析得到的样品通
？芍苯佑糜谑杷阄，无需更换缓冲液
。此表，蛋白质在低盐缓冲液中洗脱，也有利于削减后续纯化步骤中的缓冲液置换操作，从而节俭功夫并降低蛋白损失
。

6、排阻层析

排阻层析（Size Exclusion Chromatography，SEC），又称凝胶过滤（Gel Filtration）或分子筛
。排阻层析柱的填料为多孔介质，颗粒之间所能包容的液体体积称为流动相体积，也称为无效体积
。分子量较大的蛋白质无法进入填料颗粒的孔路，只能存在于颗粒间的流动相中，因而最先从柱中洗脱，这类蛋白险些不产生分离作用
。由于分歧蛋白质分子大幼分歧，其进入特定孔径颗粒内部的能力也存在差距
。分子量较大的蛋白质先被洗脱，而分子量较幼的蛋白质则后洗脱
。

为获得较好的分离成效，应选择孔径与指标蛋白分子大幼相匹配的填料，使指标蛋白的洗脱体积靠近无效体积与总柱床体积之间的中央区域
。

排阻层析拥有其他分离步骤不具备的利益：首先，可分离的蛋白分子量领域较宽，例如Tosoh Biosep公司的聚合物树脂，其分离领域可达约200,000 kDa
；其次，填料微孔结构合用于球形蛋白的分离，且整个纯化过程无需使用可能导致蛋白变性的有机溶剂
。

必要把稳的是，并非所有蛋白都适合选取凝胶过滤纯化，由于该类填料拥有肯定亲水性，带有较高电荷密度的蛋白可能产生非特异性吸附
。

排阻层析通常不用于纯化流程的早期步骤，由于该步骤要求样品高度浓缩，上样量通常仅为柱体积的1%～4%
。此表，为获得优良分离成效通常必要较长且较细的色谱柱，同时填料成本较高，因而在大规模工业出产中利用受限
。

7、电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）通常用于分析蛋白混合物样品的复杂水平以及监测蛋白纯化成效
。该步骤拥有极高的分离分辨率，但由于随着凝胶厚度增长，电泳过程中产生的热效应会严沉影响蛋白质迁徙，因而很难在不降低分辨率的情况下放大至造备规模
。

在基础钻研中，有时仅必要少量高纯度蛋白用于后续尝试，如蛋白质测序等，此时电泳纯化是一种轻便而急剧的步骤
。此表，聚丙烯酰胺凝胶电泳也是蛋白纯化过程中沉要的分析伎俩，可用于检测指标蛋白在离子互换层析分歧盐浓度洗脱组分中的散布情况，并用于评估纯化成效和蛋白纯度
。

近年来，随着性命科学有关学科的迅速发展，对蛋白纯化技术的需要不休增长，传统纯化步骤持续得到改进，同时也涌现出很多新型纯化技术
。羟磷灰石是一种磷酸钙晶体资料，早期由于其理化性质不不变、机械强度较差以及结合机能有限，难以宽泛利用于层析分离
。

近年来，Bio-Rad公司对羟磷灰石资料进行了改进，通过优化钙磷比例，造备出拥有球形、多孔且性质不变特点的陶瓷羟磷灰石颗粒
。该资猜中的带正电钙离子和带负电磷酸根离子可别离与蛋白质中的羧基和氨基产生相互作用
。通过调节缓冲液的pH值，可使酸性或碱性氨基酸残基选择性地与树脂结合
；再通过扭转盐浓度，可实现蛋白质的洗脱与分离
。

钻研批注，该步骤甚至可能有效分离等电点、分子量及疏水性均相近的蛋白质
。