蛋白质在组织或细胞中通常都是以复杂的混合物大局存在 ，每种类型的细胞都含有成千种分歧的蛋白质 。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁沉的工作 ，到目前为止 ，还没有一个单独的或一套现成的步骤能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来 ，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯法式来获取高纯度的制品 。
蛋白质提纯的总指标是设法增长制品纯度或比活性 ，对纯化的要求是以合理的效能、速度、收率和纯度 ，将必要蛋白质从细胞的全数其他成分出格是不想要的杂蛋白中分离出来 ，同时仍保留有这种多肽的生物学活性和化学齐全性 。
能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质的原因 ，是分歧的蛋白质在它们的很多物理、化学、物理化学和生物学性质有着极大的分歧 ，这些性质是由于蛋白质的氨基酸的序列和数量分歧造成的 ，衔接在多肽主链上氨基酸残基但是荷正电的、荷负电的、极性的或非极性的、亲水的或疏水的 ，此表多肽可折叠成极度确定的二级结构（α螺旋、β折叠和各类转角）、三级结构和四级结构 ，形成怪异的大幼、状态和残基在蛋白质表表的散布情况 ，利用待分离的蛋白质与其它蛋白质之间在性质的差距 ，即能设计出一组合理的分级分离步骤 。
可凭据蛋白质分歧性质与之相对应的步骤将蛋白质混合物分离：
1．分子大幼
分歧种类的蛋白质在分子大幼方面有肯定的差距 ，可用一些轻便的步骤 ，使蛋白质混合物得到初步分离 。
1．1透析和超滤
透析在纯化中极为常用 ，可除去盐类（脱盐及置换缓冲液）、有机溶剂、低分子量的抑造剂等 。透析膜的截留分子量为5000左右 ，如分子量幼于10000的酶液就有泄露的危险 ，在纯化中极为常用 ，可除去盐类、有机溶剂、低分子量的抑造剂等 。超滤通常用于浓缩和脱色
1．2离心分离置换缓冲液
很多酶富集于某一细胞器内 ，匀浆后离心得得到某一亚细胞成分 ，使酶富集10~20倍 ，再对特定的酶进行纯化 。差速离心 ，分辨率较低 ，仅合用于粗提或浓缩 。速度区带法 ，如离心功夫太长所有的物质城市沉淀下来 ，故需选择最佳分离功夫 ，可得到相当纯的亚细胞成分用于进一步纯化 ，预防了差速离心中大幼组分一路沉淀的问题 ，但容量较幼 ，只能用于少量造备 。等密度梯度离心常用的离主介质有蔗糖、聚蔗糖、氯化铯、溴化钾、碘化钠等等
1．3凝胶过滤
这是凭据分子大幼分离蛋白质混合物最有效的步骤之一 ，把稳使要离的蛋白质分子量落在凝胶的工作领域内 。选择分歧的分子量凝胶可用于脱盐、置换缓冲液及利用分子量的差距除去热源 。
2．状态
蛋白质在离心通过溶液活动时 ，或通过膜、凝胶过滤填料颗；虻缬灸褐械挠卓谆疃 ，城市受到状态的影响：对两种一样质量的蛋白质而言 ，球状蛋白质拥有较幼的有效半径（斯托克半径） ，通过溶液沉降时遇到的摩擦力幼 ，沉降较快而显得比其它状态的蛋白质大；反之 ，在体积排阻色谱时 ，斯托克半径较幼的球状蛋白质更容易扩散进入凝胶过滤填料颗粒内部 ，较迟洗脱出来 ，因而显得比其它状态的蛋白质要幼 。
3．溶化度
利用蛋白质的溶化度的差距来别离各类蛋白质常用的步骤 。影响蛋白质溶化度的表界成分好多 ，其中重要有：溶液的pH、离子强度、介电常数和温度 ，但在统一的特定表界前提下 ，分歧的蛋白质拥有分歧的溶化度 。适当扭转表界前提 ，节造蛋白质混合物中某一成分的溶化度
3．1pH节造和等电点沉淀
蛋白质在其等电点通常较不易溶化 。
3．2蛋白质的盐溶和盐析
3．3有机溶剂分级法
蛋白质在分歧的溶剂中的溶化杜仔很大分歧 ，从根基不溶（＜10μg/ml）直至极易溶化（＞300mg/ml）不等 。影响蛋白质溶化度的可造成分蕴含温度、pH、溶剂的极性、离子性质和离子强度 。引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度分歧 ，故节造有机溶剂的浓度可分离蛋白质 。
水溶性非离子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白质的沉淀 。
3．4温度
分歧的蛋白质在分歧的温度拥有分歧的溶化度和活性 。大无数蛋白质在低温下比力不变 ，故分离操作通常在0℃或更低温度下进行 。
4．电荷
蛋白质净电荷取决于氨基酸残基所带的正负电荷的总和 ，如中性溶液中带净负电荷则称为酸性蛋白质 ，
4．1电泳
不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯度的沉要伎俩 ，并且也是钻研蛋白质性质很有效的步骤 。
等电聚焦分辨率很高 ，pI有0.02pH的差距就能分隔 。
2D-PAGE分离蛋白质分辨率已经发展到100000个蛋白点 。
4．2离子互换层析
扭转蛋白质混合物溶液中的盐离子强度、pH和（阴、阳）离子互换填料 ，分歧蛋白质对分歧的离子互换填料的吸附容量分歧 ，蛋白质因吸附容量分歧或不被吸附而分离 。
洗脱可选取维持洗脱剂成分一向不变 ，也可选取扭转洗脱剂的盐度或pH的步骤洗脱 ，后一种可分分段洗脱和梯度洗脱 。梯度洗脱通常成效好 ，分辨率高 ，出格是使用互换容量幼 ，对盐浓度敏感的离子互换剂 ，多用梯度洗脱 ＝谠煜赐鸭恋奶寤ㄓ胫蔡逄寤啾龋⒀闻ǘ群蚿H ，样品组分能从离子互换柱上别离洗脱下来 。
蛋白分子露出在表表表的侧链基团的种类和数量分歧 ，故在肯定的PH值和离子强度的缓冲液的所带的电荷分歧 。
5．电荷散布
电荷的氨基酸残基可均匀地散布于蛋白质的表表 ，既能够适当的强杜纂阳离子互换柱结合也能以适当强杜纂阴离子结合 ，因无数蛋白质都有不能在单一的溶剂前提下同时与两种类型的离子互换柱结合 ，故可得用此性质纯化；电荷的氨基酸残基亦可成簇散布 ，使某一区域带强正电荷而另一区域带强负电荷 ，呈强酸性或强碱性 ，只能在极端pH与阳离子互换树脂或阴离子互换树脂结合 ，如钙调蛋白只能在pH2时与阳离子互换树脂结合 。
6．疏水性
无数疏水性的氨基酸残基藏在蛋白质的内部 ，但也有一些在表表 。蛋白质表表的疏水性氨基酸残基的数量和空间散布决定了该蛋白质是否拥有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分离的能力 。
因其廉价和纯化后的蛋白质拥有生物活性 ，是一种通用性的分离和纯化蛋白质的工具 。高浓度盐水溶液中蛋白质在柱上保留 ，在低盐或水溶液中蛋白质从柱上被洗脱 ，故出格合用于浓硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶化后的含有指标产品的溶液直接进样到柱上 ，当然也合用7mol/盐酸胍或8mol/L脲的大肠杆菌的医治蛋白质提取液直接进样到柱上 ，在分离的同时也进行了复性 。
7．密度
无数蛋白质的密度在1.3~1.4g/cm3之间 ，分级分离蛋白质时通常不常用此性质 ，不外对含有大量磷酸盐或脂质的蛋白质与通常蛋白质在密度上显著分歧 ，可用密度梯度法离心与大部门蛋白质分离 。
8．基因工程构建的纯化象征
通过扭转 cDNA在被表白的蛋白的氨基端或羧基端参与一些几个额表氨基酸 ，这个参与的象征可用来作为一个有效的纯化凭据 。
8．1GST融合载体
使要表白的蛋白质和谷胱甘肽S转移酶一路表白 ，而后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和纯化 ，再利用凝血酶或因子Xa切开 。
8．2蛋白A融合载体
使要表白的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一路表白 ，以IgG Sepharose纯化 。
8．3含组氨酸象征（Histidine-tagged）Chelating Sepharose
最通畅的象征之一 ，是在蛋白质的氨基端加上6~10个组氨酸 ，在通常或变性前提（如8M尿素）下借助它能与Ni2+螯合柱紧紧结合的能力 ，用咪唑洗脱 ，或将pH降至5.9使组氨酸充分质子化 ，不再与结合Ni2+使之得以纯化 。
沉组蛋白在设计、构建时已融入纯化构思 。样品多同化了破碎细胞或可溶产品 ，扩张床吸附技术STREAMLINE适合做粗分离 。
9．亲和能力
结合效能高 ，分离速度快的特点 。配基但是酶的底物、抑造剂、辅因子、特异性的抗体、
吸附后可扭转缓冲液的离子强度和PH的步骤 ，洗耳恭听脱下来 ，也可用更高浓度的统一配体溶液或亲和力更强的配体溶液洗脱
亲和层析固定相的配基与生物分子之间的特殊的生物大分子亲和能力分歧来进行相互分离的 ，依亲和选择性的凹凸分为：基团性亲和层析 ，固定相上的配基对一类基团的极强的亲和力 。如含有糖基的一类蛋白质或糖蛋白对三嗪染料显示出格强的吸附能力；高选择性（专一性）亲和层析 ，配基仅对某一种蛋白质有出格强的亲和性 。如单克隆抗体匹敌原的特异性的吸附 。
亲和层析除特异性的吸附表 ，依然会因分子的谬误认别和分子间非选择性的作使劲而吸附一些杂蛋白质 ，另洗脱过程中的配体不成预防的脱落进入分离系统 。
与超滤结合起来 ，将两者利益集中形成超滤亲和纯化 ，拥有高分离效能和大规模工业化的利益 ，合用于初分离 。
按配基的分歧可分为：
（1）金属螯合介质
过渡金属离子Cu2＋、Zn2＋和Ni 2＋等以亚胺络合物的大局键合到因定相上 ，由于这些金属离子与色氨酸、组氨酸和半胱氨酸之间形成了配价键 ，从而形成了亚胺金属—蛋白螯合物 ，使含有这些氨基酸的蛋白被这种金属螯合亲和色谱的固定相吸附 。螯合物的不变性受单个组氨酸和半胱氨酸解离常数所节造 ，从而亦受流动相的pH和温度的影响 ，节造前提能够使分歧蛋白质相互分离 。
（2）幼配体亲和介质
配体有精氨酸、苯甲酰胺、钙调因子、明胶、肝素和赖氨酸等等 。
（3）抗体亲和介质
即免疫亲和层析 ，配体有沉组蛋白A和沉组蛋白G ，但蛋白A比蛋白G专一 ，蛋白G能结合更多分歧源的IgG 。
（4）颜料亲和介质
染料层析的成效除重要取决于染料配基与酶的亲和力大幼表 ，还与洗脱缓冲液的种类、离子强度、PH值及待分离的样品的纯杜仔关 。配体有Cibacron Blue和Procion Red两种 。在肯定的前提下 ，固定化的染料能起阳离子互换剂的作用 ，为了预防此景象的产生 ，最好要离子强度幼于0 。1和PH大于7时操作 。
（5）表源凝聚素亲和介质
配体有刀豆球蛋白、扁豆表源凝聚素和麦芽表源凝聚素 ，固相表源凝聚素能和数种糖类残基产生可逆反映 ，适合纯化多糖、糖蛋白 。
10．非极性基团之间作使劲
溶质分子中的非极性基团与非极性固定相间的相互作使劲（非选择性分散力或伦敦力）大幼与溶质分子极性基团与流动力相中极性分子在相反方向上相互作使劲的差距进行分离 。因其流动相中的置换剂是极性幼于水的有机溶剂（如甲醇、乙腈、四氢呋喃等） ，这些有机溶剂可能使很多蛋白质分子产生不成逆的变性；流动相中须有离子对试剂（如三氟乙酸、甲酸、磷酸等）存在才可使分离有效地进行和获得高的质量回收率；分离须在酸性介质中进行（通常pH在2~3之间） ，又有一些蛋白质会在后两种前提下产生不成逆的分子构象变动 ，故在生物大分子中人分离纯化中受到限度 ，但分子构象变动可逆的蛋白质而言是有效的步骤 。
正相色谱在生物大分子中的分离和纯化中利用相对较少 ，因所用的溶剂很贵 。
11．可逆性缔合
在某些溶液前提下 ，有一些酶能聚合成二聚体、四聚体等 ，而在另一种前提下则形成单体 ，如相继在这两种分歧的前提下按大幼就能够进行分级分离 。
12．不变性
12．1热不变性
大无数蛋白质加热到95℃时会解折叠或沉淀 ，利用这一性质 ，可容易地将一种经这样加热后仍维吃熹可溶性活性的蛋白质从大部吩熹它细胞蛋白质中分脱离 。
12．2蛋白酶解不变性
用蛋白酶处置上清液 ，消化杂蛋白 ，留下抗蛋白酶解抗性蛋白质 。
13．分配系数
即利用双水相萃取分离 ，常用的生物物质分离系统有：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（DEXTRAN）、PEG/磷酸盐、PEG/硫酸铵等 。由于拥有含水比例高、选用的聚合物及盐对酶无毒性、分离设备与化学工业通用蹬着点 ，在工业上目益受器沉 。
分配行为受聚合物分子大幼、成相浓度、PH、无机盐种类等成分影响 ，
发展：拥有亲和双水相萃取及膜分离双水相萃取等新型双水相分离技术 。
双向水溶液系统的蛋白质纯化
一些与水混合多聚物的不相溶性导致依赖于多聚物浓度的两相系统的液-液分配技术 ，能够由两分歧的高水溶性的多聚物或一种多聚物各一种盐 ，用于从微生物匀浆中除支细胞碎片、后续分配步骤进一步纯化 。分离的选择性通常随着分离分子或颗粒大幼面增长 。
14．表表活性
14．1泡沫分离
蛋白质溶液拥有表表活性 ，气体在溶液中鼓泡 ，气泡与液相主体分离 ，在塔顶富集 ，达到分离和浓缩的主张 。
14．2反胶团相转移法
反胶团相转移法是80年代鼓起的一种新型分离技术 ，它利用表表活性剂分子在有机溶剂中自觉形成的反向胶团（反胶团） ，在肯定前提下将水溶性蛋白质分子增溶进反胶团的极性核（水池）中 ，再创造前提将蛋白质抽提至另一水相 ，实现蛋白质的相转移 ，达到分离和提纯蛋白质的主张 。反胶团中的蛋白质分子受到周围水分子和表表活性剂极性头的； ，仍维持肯定的活性 ，甚至阐发出超活性 。由于蛋白质增溶于反胶团与蛋白质所带电荷及反胶团内表表电荷间的静电作用及反胶团的大幼有关 ，因而表表活性剂的种类、水溶液的pH值及离子强度等成分均影响反胶团对蛋白质的相转移 。据报路利用AOT／异辛烷反胶团对酵母脂肪酶进行相转移 。
14．3聚合物-盐-水液-固苯取系统是90年代在国内开发的种新的萃取系统 ，成功地用于萃取金属离子及卞果酸脱氢酶等生物活性物质较强的吸附及乳化作用等缺点 ，成相容易成相后直接倾出液相即可使液固的相分离 ，勿需特殊技术处置 ，不用有机溶剂 ，无毒性 ，成相聚合物及盐对生物活性物质有不变和；ぷ饔 ，萃取分离选择性好亏损低、易于规模放大的分离生队物活件物质的新技术在聚乙二醇建饰物的聚乙二醇／葡聚糖双水相萃取系统共价作用：重要用于含巯基酶的纯化 ，通过共价键结合在层析介质上 ，偶联是可逆的 ，能还原二硫键的低分子化合物洗脱 ，如空间位阻 ，可在含变性剂的缓冲液时吸附 ，如已含二硫键 ，则吓酌还原剂打开 。
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