SARS-CoV-2是一种有包膜的单链RNA 病毒，病毒RNA通过核糖体移码产生两个多聚蛋白：pp1a和pp1ab。多蛋白由木瓜蛋白酶样蛋白酶（PL pro）处置，其切割3个位点开释非结构蛋白nsp1-3和一种3C样蛋白酶，也称为重要蛋白酶（M pro）。在11个位点切割以开释非结构蛋白，这些非结构蛋白形成复造酶复合体，掌管病毒基因组的复造和转录，因而使得M pro和PL Pro成为抗病毒药物开发的重要指标。
结构生物学能够起到药物开发的关键作用，但直接靶向SARS-CoV-2的药物依然令人难以捉摸。近日，《Nature Communications》上的一篇新论文概述了一个国际钻研团队若何确定潜在的步骤，以急剧设计出与COVID-19匹敌的改进且职能更强的化合物。钻研人员通过结合质谱和X射线步骤对SARS-CoV-2主蛋白酶进行了大规模的亲电试剂和非共价片段筛选病毒复造，晶体学屏幕确定了覆盖整个活动位点的71个匹配以及二聚体界面的3个匹配。这些组合提供了前所未有的结构和反映性信息，可用于在进行的针对SARS-CoV-2主蛋白酶结构的药物设计。
Part 1
M pro以无配体大局结晶，衍射至靠近原子分辨率
不含配体的M pro的晶体结构适合X射线片段筛。ㄆ鹪矗篘ature Communications）
晶体大局极度适合晶体碎片筛查，只管蛋白晶体的溶剂百分比极度低，但是依然存在清澈的通路能够通过扩散进入活性位点。此表，当向结晶液滴中增长可溶化的碎片时，缜密堆积和牢固的先天衍射均匀晶体可抵抗晶格粉碎和DMSO溶剂对衍射的降解。
Part 2
结合MS和晶体学碎片筛查揭示了M pro的新结合剂
结晶碎片屏幕的功夫线（起源：Nature Communications）
为了确定共价起点，钻研人员使用齐全蛋白质谱法筛选了先前描述的针对Mpro的约1000个轻度亲电片段库。含有化合物N-（chloroacetyl）aniline基序是频仍击打者，由于这样的化合物是高反映性的。因而，钻研人员选择反映性相对较低的系列成员进行后续结晶尝试，对于蕴含N-氯乙 ；哙せ-4-羧酰胺基序的另一系列射中化合物，它们显示较低的反映性并且在以前的筛选中不断时产生击打。
固然和善的亲电片段极度适合探测活性位点半胱氨酸周围的结合个性，但它们的幼尺寸却阻止了对底物结合的宽泛索求。钻研人员进行了另一次晶体学碎片筛查，以详尽地探查Mpro活性位点，并寻找碎片归并或成长的机遇。将68个亲电子片段射中以及来自7个文库的总共1176个怪异片段增长到晶体中，非共价片段被浸泡，而亲电试剂片段既被浸泡又被共结晶，以确保在结构上观察到尽可能多的质谱图。总共1742次浸泡和1139次共结晶尝试产生了1877个镶嵌晶体，只管有些碎片粉碎了晶体或衍射，但依然网络到了1638个分辨率高于2.8?的数据集。
Part 3
非共价片段射中揭示了活性位点中的多个可靶向亚位点
钻研人员共鉴定出八个片段结合在S1亚位点上，并通过吡啶环或类似的含氮杂环与关键残基的侧链形成相互作用，通过酰胺或脲部门中的羰基与Glu166形成相互作用。与其他亚位点相比，亚位点S2先前已显示出更大的矫捷性，可适应肽基抑造剂中较幼的取代基，但会优先选择亮氨酸或其他疏水残基。很多片段在此地位结合，钻研人员称其为“芳香轮”，是由于芳香环的一致基序与Met49形成疏水相互作用，或与His41形成π-π堆积，基团别离在4个轴向上搁置。
结合的片段对活动位点进行了全面采样（起源：Nature Communications）
在索求亚位点S3的四个片段中，其中三个片段带有一个磺酰胺基的芳环，该磺酰胺基与Gln189形成氢键，并朝着溶剂界面指向活性位点，这些射中拥有适合利用上述一样的His164 / Met165 / Asp187口袋的扩大载体。
已经确定，对于类似的病毒蛋白酶如SARS-CoV的-1蛋白酶的生物学单元是二聚体，并且在突变二聚体界面能够粉碎蛋白酶活性，因而滋扰二聚化的化合物可能充任蛋白酶活性的准变构抑造剂。在这项钻研中，三种化合物结合在二聚体界面的可及地位，能够设想到利用它们来设计化合物来粉碎M pro二聚体。
二聚体界面的片段暗示变构调节的机遇（起源：Nature Communications）
片段Z1849009686（×1086）结合在由Met6、Phe8、Arg298和Val303的侧链形成的疏水口袋中，它还介导了两个氢键与Gln127的侧链和Met6的骨架。Z264347221（×1187）类似地结合在由Met6，Phe8和Arg298造成的疏水性口袋中，延长穿过二聚体界面以与第二个原发性蛋白的Ser123、Tyr118和Leu141相互作用，蕴含氢键Ser123的侧链和主干。最后是POB0073（x0887），在二聚体界面处仅与Gly2结合4?，被包裹在一个前体的Lys137和Val171之间，而另一个包裹在Gly2、Arg4、Phe3、Lys5和Leu282之间，蕴含两个与Phe3骨架相连的氢键。
Part 4
共价片段射中揭示了几个易处置的系列
在所有拥有亲电试剂结合的结构中，N-氯乙 ；驶踉佑隚ly143、Ser144或Cys145的骨架酰胺氢形成两个或三个氢键，蕴含N-氯乙 ；哙せ-4-羧酰胺基序的所有三种化合物都选取类似的指向S2口袋的结合方式。
共价片段锚定在Cys145处并取样正构M pro结合袋的分歧区域（起源：Nature Communications）
一系列含有N-氯乙 ；哙せ-4-羧酰胺基序的化合物显示出了有前途的结合模式。为了跟踪这些化合物，钻研人员进行了第二代化合物的急剧合成。通过N-氯乙 ；哙-4-羰基屡纂各类内部胺（优选带有发色团以简化纯化）的反映，能够以毫克级获得这种化学型的衍生物。这些新化合物通过齐全蛋白质质谱法测试，以评估蛋白质象征。源自非极性胺的酰胺大多胜过其极性对应物，这暗示了在该方向上可靶向的亲脂性亚区域。两种拥有最高象征的PG-COV-35和PG-COV-34的酰胺凸起显示了别离通过酰胺N-烷基化或交叉偶联进一步合成衍生化的潜力。
凸起显示的结构-活性关系对于进一步优化很沉要。溴炔拥有固有的硫醇反映性，它比已成立的基于丙烯酰胺的共价抑造剂的固有硫醇反映性低。炔烃的几何状态及其结合方式也批注，能够用可逆的共价基团（例如腈）包办，它能够通过一样的非共价相互作用进行疏导。两个共价射中物（2-氰基嘧啶和2-氰基咪唑）来自幼型杂环亲电子试剂库，它们内容上是由五元和六元氮组成，含拥有吸电子个性的杂环，可激活幼的亲电子取代基（卤素，乙基，乙烯基和腈基）。
Part 5
了局与会商
本钻研提供的数据为从SARS-CoV-2开发有效的M pro抑造剂提供了很多明确的蹊径。结合的片段全面采样了活性位点的所有子位点，揭示了分歧的扩增载体，并且亲电试剂为设计共价化合物提供了系统的和无意的宽泛数据。人们普遍以为，新的幼分子药物不能以足够快的速度开发出来以援试欹敌COVID-19。然而，由于大盛行病威胁仍将是一个持久问题，并且候选疫苗不能保障提供全面和悠久的 ；，因而抗病毒分子将依然是沉要的防御线，这类化合物还必要与未来的盛行病作奋斗，此项钻研得出的数据将加快此类工作进展。
总的来说，共价射中提供了低反映性和高选择性抑造剂的合理蹊径。合理设计的共价药物获得牵引力，很多最近FDA核准的药物，它们的设计是基于极度有效的非共价结合，即允许低反映性亲电的精确定位，所以共价键的形成即是结合位点特异性的依赖。碎片步骤已成为现代药物发现的一种重要步骤，使用了少量化合物（ < 300Da）的幼集中 （100s或1000s ），这些化合物杂乱地结合在一路，因而比HTS获得的化学空间要大得多。面对的挑战是，片段击中的结合极度弱，必要高度活络的生物物理检测，对结合的仔细确认以及专业的化学知识能力将这些击中并发展为齐全有效的候选药物。但真正的但愿是能够将它们急剧有效地转化为有效的候选药物，并通过更单一的蹊径将其转化为临床药物。
世界上的焦点一向放在疫苗和现有药物的再利用上，但是该项钻研是少数尝试新型幼分子疗法的项目之一。该钻研团队采取了极为分歧寻常的蹊径，即在天生所有尝试数据后立即将其颁布，因而了局将可供全球任何一家药品造作商使用。国际社会对此项钻研数据实时颁布的反映更为杰出，纷纷调动了大量的专业知识、技术和慈悲事业，并演造成一种怪异而严格的药物发现工作旨在迅速开发出拥有优良安全性和临床前个性的的口服抗病毒药物。JDB电子作为新药研发CRO也会持续关注此项钻研进展。
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