急性毒性试验/沉复给药筛选试验

急性毒性评价是体内安全性评价的根基类型之一，药品注册通常必要发展急性毒性评价。急性毒性试验所得数据在安全性评价中拥有沉要作用，可在初步毒性特点描述中用于确定最大耐受剂量（MTD）或最幼致死剂量（MFD）。这些数据还可为安全药理学试验及沉复给药毒性试验的剂量选择提供凭据。

此表，急性毒性试验可用于早期候选药物的筛选，亦可与单一的沉复给药毒性筛选试验结合发展。必要把稳的是，只有在获得与给药蹊径和临床适应症有关的生物利用度及系统露出数据的前提下，急性毒性钻研了局能力提供更具价值的安全性信息。

（一）急性毒性（沉复给药筛选试验）

急性毒性试验可选取多种钻研大局，但其重要主张根基一致，即评估候选药物在临床预期剂量若干倍水平下的耐受性。筛选试验的优势在于可在统一钻研中同时比力多个候选化合物。耐受性指标（如体沉变动、饲料亏损量变动及异常临床症状等）可为判断候选药物的相对安全性提供参考凭据。

在此类钻研中，动物种类的选择通常不要求覆盖所有动物种属，但至少应评价一种啮齿类动物。对于拟持久逐日给药的药物，在5～7天的露出周期内发展沉复给药耐受性评价也是可行的，这有助于初步评估临床病理学终点的潜在变动，并为后续毒性试验的剂量设计提供参考。但该类筛选试验不能代替用于注册申报的正式急性毒性试验。

（二）急性毒性试验的根基设计

急性毒性试验通常设置每组动物数量相对较少的多个剂量组。对于啮齿类动物钻研，每个剂量组每个性别设置5只动物通常已足够
；第二种动物种类通常每组使用2～3只动物。试验中应设置溶媒对照组，并至少设置3个供试品剂量组
；在对供试品毒理学个性相识有限的情况下，可适当增长剂量组数量。

在单次赐与供试品后，应对动物的体沉、饲料亏损量及临床症状进行系统观察，以获取毒理学作用的关键信息。在划定观察期实现后（通常为给药后第14天），对存活动物执行安泰死并进行大体解剖查抄，沉点评估组织和器官的肉眼可见病变。通常情况下，不再对上述组织进前进一步的组织病理学查抄。

急性毒性评价通常侧沉于显著毒性反映的观察，蕴含体沉变动、饲料亏损削减、殒命或濒死阐发，以及与供试品有关的药理学作用等临床指标。急性毒性试验了局可为后续沉复给药毒性试验的剂量设计提供沉要参考。

急性毒性试验服务项目：

调查受试药物在幼鼠中的半数致死量（LD??）或最大耐受剂量（Maximum Tolerated Dose，MTD）。
半数致死量（Median Lethal Dose，LD??）：在肯定试验前提下，可引起 50% 的受试动物殒命的剂量，该数值通过统计学步骤推算获得。
最大耐受剂量（Maximum Tolerated Dose，MTD）：在既定试验前提下，不引起受试动物殒命且未出现显著不成接受毒性反映的最高给药剂量。

服务内容：

1、发展幼鼠急性毒性预试验，用于确定合理的剂量设计
；
2、 凭据受试药物的理化性质和作用特点，选择相宜的给药蹊径，蕴含灌胃、静脉注射、腹腔注射和皮下注射等
；
3、 对出现异常阐发的动物进行必要的病理组织学查抄。

一、概述

动物急性毒性试验（Acute toxicity test，Single dose toxicity test）

是指钻研动物在一次给药或在 24 幼时内屡次赐与受试物后，于肯定观察期内所产生的毒性反映。拟用于人体的药物通常必要发展动物急性毒性试验。

急性毒性试验处于药物毒理学钻研的早期阶段，对于说明药物的毒性作用特点及鉴别潜在毒性靶器官拥有沉要意思。急性毒性试验所获得的信息可为持久毒性试验的剂量设计以及部门药物Ⅰ期临床试验肇始剂量的选择提供沉要参考，并可提供与人类药物过量所致急性中毒有关的基础信息。

急性毒性试验的设计应在充分相识受试物有关信息的基础上，遵循“具体问题具体分析”的准则。应凭据化合物的结构特点、理化性质、适应症特点及试验主张等成分，选择合理的试验步骤，造订合适的试验规划，并结合其他药理学和毒理学钻研了局，对试验数据进行全面评价。

急性毒性试验应遵循通常动物试验的根基准则，即随机、对照和可沉复性。

二、根基概想

最大无毒性反映剂量（未见不良反映剂量，No Observed Adverse Effect Level，NOAEL）：

指受试物在一按功夫内以特定方式赐与机体，在选取活络的检测步骤和观察指标的前提下，未观察到任何不良反映的最高剂量。

最幼毒性反映剂量：

动物出现毒性反映的最幼剂量。

最大耐受剂量（Maximum Tolerated Dose，MTD）：

指在划定试验前提下，动物可耐受且未出现殒命或不成接受毒性反映的最高给药剂量。

最幼致死剂量（Minimal Lethal Dose，MLD）：

指在肯定试验前提下，引起个别受试动物殒命的最低剂量。

半数致死量（Median Lethal Dose，LD??）：

指在肯定试验前提下，引起 50% 的受试动物殒命的剂量，该数值通过统计学步骤推算获得。

三、钻研内容

（一）受试物

急性毒性试验所用受试物应为造备工艺不变、切合临床试验用质量尺度要求的样品。应明确注明受试物的名称、起源、批号、含量（或规格）、保留前提及配造步骤等信息，并附研造单元出具的自检汇报。所用辅料、溶媒等亦应注明其批号、规格和出产厂家，并切合试验有关要求。

（二）动物

1.种属：
分歧种属动物拥有各自的生理特点，对统一药物的毒性反映可能存在差距。啮齿类动物与非啮齿类动物急性毒性试验所得了局在毒性阐发的性质和水平上均可能分歧。为充分表征受试物的毒性特点，应从啮齿类动物和非啮齿类动物中获得较为全面的安全性信息。因而，急性毒性试验准则上应选取至少两种哺乳动物，通常选用一种啮齿类动物和一种非啮齿类动物。如未选取非啮齿类动物，应对其合理性作出注明。

2.性别：
通常应选取两种性此外试验动物，雌雄参半
；如仅选取单一性别动物进行试验，应说明其科学凭据和合理性

3.春秋：
通常选取健康成年动物进行试验。若是受试物拟用于儿童或可能用于儿童，建议必要时选取少幼动物进行试验。

4.动物数：
试验动物数量应凭据动物种属和钻研主张合理确定，并满足试验步骤及了局分析评价的必要。在保障获得充分信息的前提下，应尽量削减动物使用数量

5.体沉：
试验动物的初始体沉不应超过或低于均匀体沉的 20%。

可凭据试验主张及受试物特点，综合确定试验动物的性别、春秋等前提。所有试验动物均应切合国度有关尝试动物等级要求，起源、品系及遗传布景明显，并拥有尝试动物质量合格证明。

（三）给药蹊径

分歧给药蹊径会影响受试物的吸收速度、吸收率及系统露出水平，因而急性毒性试验可选取分歧的给药蹊径。通过比力分歧给药蹊径下的毒性了局，还可获得初步的生物利用度有关信息。

通常情况下，给药蹊径应至少蕴含临床拟用蹊径以及一种可能使真相药物较齐全进入体循环的蹊径（如静脉注射）。若临床拟用蹊径自身为静脉给药，则仅选取该蹊径即可。

经口给药前，动物通常需禁食一段功夫（通常为一夜），但不禁水。由于胃内容物可能影响给药容量，而禁食功夫的长短亦可能影响啮齿类动物药物代谢酶活性及肠路吸收，从而影响毒性露出水平。

（四）给药剂量水平

急性毒性试验的沉点在于观察动物的毒性反映阐发？善揪葑暄兄髡叛≡袷实钡牟街璺⒄辜毙远拘宰暄。对于非啮齿类动物，给药剂量达到出现显著毒性反映即可，通常毋庸达到致死水平。

总体而言，给药剂量应覆盖从未见毒性反映剂量至出现严沉（危及性命）毒性反映的剂量领域，并设置空缺对照组和/或溶媒（辅料）对照组。分歧动物种属及给药蹊径下的最大给药容量可参考有关文件并结合现实情况确定。

（五）观察功夫及指标

给药后，通常陆续观察至少14天，观察的距离和频率应合理设置，以便能观察到毒性反映出现的功夫及其复原功夫、动物殒命功夫等。观察的指标蕴含通常指标（如动物表观、行为、对刺激的反映、排泄物、渗出物等）、动物殒命情况（殒命功夫、濒死前反映等）、动物体沉变动（给药前及试验实现正法前至少各称沉一次，观察期间可适当增长称沉次数）等。纪录所有的殒命情况、出现的症状，以及症状肇始的功夫、严沉水平、持续功夫等。

（六）病理学查抄

所有的试验动物均应进行大体解剖，蕴含试验过程中因濒死而正法的动物、殒命的动物以及试验实现时仍存活的动物。凡发现组织或器官在体积、色彩或质地等方面出现异常扭转，均应予以纪录，并进一步进行组织病理学查抄。

四、数据分析及评价

（一）了局处置和分析

1.凭据所观察到的各类反映出现的功夫、严沉水平、持续功夫等，分析各类反映在分歧剂量水平下的产生率、严沉水平。凭据观察了局综合分析，判断每种反映的剂量－反映关系和功夫－反映关系。
2.结合临床观察了局，判断已出现的毒性反映可能涉及的组织、器官或系统。
3.凭据大体解剖中观察到的肉眼可见病变及组织病理学查抄了局，初步判定可能的毒性靶器官。组织病理学查抄应形成规范的病理学汇报，并由病理学查抄掌管人署名，同时加盖药品注册申请人公章
；对存在病变的组织应提供相应的病理学照片。
4.综合分歧剂量组的毒性反映类型、产生率及动物殒命情况，确定动物对受试物的未见毒性反映剂量和严沉毒性反映剂量。为此，可选取适当的试验和评价步骤，测定最大无毒性反映剂量或最幼毒性反映剂量，以及最大耐受剂量、近似致死剂量或最幼致死剂量等，以初步界定受试物的安全领域。
5. 对于必要测定LD50的药物，应选取合理的统计学步骤对其进行求算。
6. 注明所使用的推算步骤和统计学步骤，并提供所选步骤合理性的凭据。

（二）综合评价

综合思考分歧剂量水平下毒性反映的出现功夫、产生率、剂量–反映关系，以及分歧动物种属、尝试室汗青对照数据、病理学查抄了局和同类药物的毒性特点，判断观察到的毒性反映与受试物之间的有关性。
在此基础上，总结受试物的安全领域、毒性反映的严沉水平及其可逆性
；并结合毒性可能涉及的部位，综合大体解剖和组织病理学查抄了局，初步判定其毒性作用靶器官。
急性毒性试验了局可为后续毒理学钻研的剂量选择提供凭据，并提醒后续钻研中需沉点关注的毒性指标。此表，通过比力分歧给药蹊径下动物的反映情况，可对受试物的生物利用度作出初步判断，为剂型开发提供参考。

五、急性毒性试验常用试验步骤

由于受试物的化学结构和活性成分含量分歧，其毒性反映的类型和强度亦存在差距。因而，钻研者应凭据受试物的特点，选择以下试验步骤，或选取国内表公认的其他急性毒性试验步骤。

1. 近似致死剂量法

该步骤重要用于非啮齿类动物的急性毒性试验，试验步骤如下：

通常选取6 只健康的Beagle 犬或猴。犬的春秋通常为4-6 月龄，猴的春秋通常为2-3 岁，如选用其他动物种属，应注明其科学凭据和合理性。

凭据幼动物毒性试验了局、受试物的化学结构及其他有关资料，估计可能引起毒性反映和殒命的剂量领域，并按 50% 递增准则设计蕴含多个剂量水平的剂量序列表。

凭据估计，由剂量序列表中找出可能的致死剂量领域，在此领域内，每距离一个剂量赐与一只动物，测出最低致死剂量和最高非致死剂量，随后，拔取两者之间的中央剂量再赐与 1 只动物。若是该剂量下动物未产生殒命，则该剂量与最低致死剂量之间的领域可作为近似致死剂量领域
；若是该剂量下动物殒命，则该剂量与最高非致死剂量间的领域可作为近似致死剂量领域。

2. 最大给药量法

对于某些毒性较低的受试物，可选取最大给药量法进行急性毒性评价。在合理确定最大给药浓度和给药容量的前提下，以允许的最大剂量进行单次给药，或在 24 幼时内屡次给药（总剂量通常不超过 5 g/kg 体沉），观察动物出现的毒性反映。

该步骤通常使用 10～20 只试验动物，给药后陆续观察不少于 14 天。

3. 固定剂量法（Fixed-dose procedure）

固定剂量法最初于 1984 年由英国毒理学会提出。该步骤不以动物殒命作为重要观察终点，而是以明确且可观察到的毒性体征作为评价凭据。

试验通常选择 5、50、500 和 2000 mg/kg 四个固定剂量进行钻研
；在特殊情况下，可增长 5000 mg/kg 剂量。试验动物首选大鼠。给药前禁食 6～12 幼时，给药后持续禁食 3～4 幼时。试验选取一次给药方式进行。若无资料批注雄性动物对受试物更为敏感，预试应首先选取雌性动物。

凭据受试物的有关资料，从上述四个剂量当选择一个作为初始剂量
；如不足可供参考的资料，可选用500mg/kg作为初始剂量进行预试。若该剂量未出现毒性反映，则可选取 2000 mg/kg 进行预试
；如在该剂量下未观察到动物殒命，可终止预试。若初始剂量出现严沉的毒性反映，即降低一个档次的剂量进行预试，如此时动物存活，就在此两个固定剂量之间选择一个中央剂量进行试验。每个剂量给一只动物，预试通常不超过5只动物。每个剂量试验之间至少应距离24幼时。给受试物后的观察期至少7天，如动物的毒性反映到第7天依然存在，尚应持续观察7天。

在上述预试的基础上进行正式试验。每个剂量至罕用10只动物，雌雄参半。凭据预试的了局，在上述四种剂量当选择一个可能产生显著毒性但不导致殒命的剂量用于正式试验
；如预试了局批注，5.0mg/kg 即可引起动物殒命，则应降低一个剂量档次进行正式试验。

给药后观察期不少于 2 周，凭据毒性反映的具体特点可适当耽搁。对每只动物均应仔细观察并具体纪录各类毒性反映出现和隐没的功夫。给药当天至少应观察纪录两次，以来可每天一次。观察纪录的内容蕴含皮肤、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循环、自主活动及中枢神经系统行为阐发等。动物殒命功夫的纪录要正确。

赐与受试物前、后各1周、动物殒命及试验实现时应称取动物的体沉。所有动物蕴含殒命或正法的动物均应进行尸检，尸检异常的器官应作组织病理学查抄。固定剂量法试验了局应参拍照应评价尺度进行判定。

4. 高凳专（阶梯法，序贯法，Up and down method）

该步骤由Dixon和Mood初次提出，1985年Bruce对其进行了改进，目前是OECD和EPA推荐的急性毒性试验步骤之一。该步骤的重要特点是可显著削减试验动物的使用数量，同时不仅可能观察毒性阐发，还可估算 LD?? 及其相信区间，合用于可能引起试验动物急剧殒命的受试物。

高凳专蕴含限度试验和主试验两部门。限度试验重要用于已有资料提醒受试物毒性可能较低的情况，有关毒性信息可起源于与受试物有关的化合物、类似混合物或产品。当有关毒性资料较少或不足，或预期受试物拥有显著毒性时，应直接发展主试验。

限度试验：是一种最多用5 只动物进行的序列试验。常用试验剂量为2000 mg/kg，在特殊情况下也可使用5000 mg/kg。

2000 mg/kg剂量水平的限度试验: 将受试物赐与1 只动物。若是该动物殒命，则进行主试验
；若是该动物存活，顺次将受试物赐与另表4只动物，动物总数为5只。

若是1 只动物在试验后期殒命，而其他动物存活，应终场对其他动物给药，对所有动物进行观察，是否在类似的观察期间也产生殒命。后期殒命的动物应与其他殒命的动物同样计数，对了局进行如下评价: 有3 只或3 只以上动物殒命时，LD50幼于2000mg/kg
；有3只或3只以上动物存活时，LD50大于2000 mg/kg
；若是有3 只动物殒命，则进行主试验。

5000mg/kg剂量水平的限度试验:特殊情况下，可思考使用5000mg/kg的剂量。将受试物赐与1只动物。若是该动物殒命，则进行主试验
；若是该动物存活，将受试物赐与另表2只动物。若是这2只动物都存活，则LD50大于5000mg/kg，终场试验（即不再对其他动物给药，观察14天）。若是这2只动物中有1只殒命或者2只均殒命，将受试物赐与另表2只动物，一次1只。若是1只动物在试验后期殒命，而其他动物存活，应终场对其他动物给药，对所有动物进行观察，是否在类似的观察期间也产生殒命。后期殒命的动物应与其他殒命的动物同样计数，对了局进行如下评价。有3只或3 只以上动物殒命时，LD50幼于5000 mg/kg
；有3 只或3 只以上动物存活时，LD50大于5000 mg/kg。

主试验:由一个设定的给药法式组成，在此法式中，每次给药1只动物，距离至少48幼时。给药距离取决于毒性出现功夫、持续功夫和毒性的严沉水平。在确信前一只动物给药后能存活之前，应推迟按下一剂量给药。功夫距离能够适当调整，但使用单一功夫距离时，试验会更轻便。

第一只动物的给药剂量低于LD50的最靠近的估计值。若是该动物存活，第二只动物赐与高一级剂量
；若是第一只动物殒命或出现濒死状态，第二只动物赐与低一级剂量。剂量级数因子应选定为1/（剂量-反映曲线斜率估计值）的否决数（对应于斜率2的级数因子为3.2），并应在整个试验过程中维持不变。当没有受试物的斜率的有关资料时，使用3.2为剂量级数因子。

使用默认级数因子时，剂量应从以下序列当选择：1.75、5.5、17.5、55、175、550、2000mg/kg（或有特殊要求时1.75、5.5、17.5、55、175、550、1750、5000mg/kg）。若是没有受试物的致死估计值，应该从175mg/kg起头。若是预期动物对该受试物的耐受水平变动很大（即，估计斜率幼于2.0），那么起头试验前应试虑增长剂量级数因子超过按对数剂量推算的默认值0.5（即，级数因子为3.2）。同样，对于已知斜率很陡的受试物，应选择幼于默认值的级数因子。

在决定是否及若何对下一只动物给药之前，每只动物都该当真观察达48幼时。当满足终场试验尺度之一时，终场给药，同时凭据终止时所有动物的状态推算LD50估计值和可信区间。 用最大可能性法推算LD50值 (美国EPA开发了相应的推算软件，AOT425StatPgm)。

当满足下列终场试验尺度之一时，终场试验：

（a） 陆续3 只动物存活
；

（b） 肆意陆续6 只试验动物，有 5 次陆续产生计活/殒命状态转换
；

（c） 第一只动物产生转换之后至少有4 只动物进入试验，并且其LD50估算值的领域超出临界值（2.5 倍）。（初次转换的第4 只动物之后，对每次给药进行推算）。

对于LD50和斜率的各类组合，在动物产生殒命/存活转换之后，用4~6只动物即可满足终场试验尺度（C）。但在一些情况下，化合物的剂量-反映曲线的斜率较幼，可能另表还必要增长动物（总共可达15 只）。

5. 累积剂量设计法（金字塔法，Pyramiding dosage design）

在非啮齿类动物的急性毒性试验中可选取该步骤。经典的试验设计通常必要8只动物，设置对照组和给药组，每组4只动物，雌雄各2只。

剂量的设计可所以1、3、10、30、100、300、1000、3000mg/kg，也能够选取10、20、40、80、160、320、640、1280mg/kg，通常隔日赐与下一个高剂量，剂量逐步加大，直到出现动物殒命时或达到剂量上限时为止。

当没有动物殒命时，MLD（最幼致死剂量）和LD50大于最高剂量或受限度剂量。当在某一剂量所有动物均出现殒命时，MLD和LD50应在最后两个剂量之间。当在某一剂量部门动物出现殒命，部门殒命呈此刻后继的下一个高剂量，此时，MLD位于初次出现殒命的剂量和前一低剂量之间，LD50则应在初次出现动物殒命的剂量和所有动物均殒命的剂量之间。

若整个试验过程中未出现动物殒命，时时以最高剂量赐与动物5-7 天，以为后续沉复给药毒性试验中高剂量的选择提供凭据。

6. 半数致死量法

半数致死量法是一种经典的急性毒性试验步骤，通过对试验了局进行统计学分析，可获得受试物的半数致死量（LD??）